以泰國T.W.Flegel教授以及臺灣羅竹芳教授為首的研究人員已經(jīng)公開確定引起急性肝胰腺壞死?。╤epatopancreatic necrosis disease,AHPND)的那株特異性副溶血性弧菌的PCR快速檢測的方法,并且公布了檢測方法的PCR引物以及反應(yīng)方法。
前言:
在泰國,實驗由Centex Shrimp (泰國瑪希隆大學(xué)杰出人才中心對蝦研究組)、瑪希隆大學(xué)公共衛(wèi)生部和水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)研究中心部、水產(chǎn)科學(xué)研究院、農(nóng)業(yè)大學(xué)等多名研究人員完成的。自2011以來,這項工作得到了農(nóng)業(yè)研究發(fā)展機構(gòu)、臺灣國家科學(xué)委員會等多個機構(gòu)的資金支持。
2013年12月5日,研究人員通過獲得的基因序列的對比信息,參照對比信息可以測試不同的PCR檢測方法,他們花了近20天的時間來驗證不同的PCR檢測,并公布了他們認為最好的檢測方式。
PCR 操作:
預(yù)熱 : 94°C, 5min
PCR 25~30 cycles with:
變性 : 94°C, 30 sec
退火 : 60°C, 30 sec
延伸 : 72°C, 60 sec
后延伸 : 72°C, 10 min
擴增產(chǎn)物 : ~700 bp
AHPND 引物組1 (AP1)
AP1F:- 5’- CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATG -3’
AP1R:- 5’- GCAAACTATCGCGCAGAACACC -3’
AP1擴增產(chǎn)物為700 bp
AHPND 引物組2 (AP2)
AP2F:- 5’- TCACCCGAATGCTCGCTTGTGG -3’
AP2R:- 5’- CGTCGCTACTGTCTAGCTGAAG -3’
AP2擴增產(chǎn)物為700 bp
正文如下:
目前,養(yǎng)蝦業(yè)在亞洲的經(jīng)濟局勢非常嚴峻,由對蝦死亡和停止養(yǎng)蝦造成的經(jīng)濟損失非常大。我們相信及時公布檢測方法,降低AHPND暴發(fā)風(fēng)險的所獲得的收益,遠遠比從檢測產(chǎn)品中收到的專利費用以及我們研究所需要的費用要多。如果要申請專利,還需要推遲幾周甚至到幾個月的時間用來準備文件,以及準備足量的商業(yè)檢測試劑盒投入市場,以滿足市場需求。我們無法預(yù)測推遲幾天、幾周甚至幾個月里,將造成的潛在市場經(jīng)濟損失。
基于以上諸多因素,我們決定公開AHPND的PCR檢測操作方法,允許這些信息更為廣泛、迅速的傳播,以減少暴發(fā)AHPND的風(fēng)險。
雖然我們已經(jīng)做了大量測試,但由于樣本數(shù)還是有限的,簡單地說,我們發(fā)現(xiàn)以下幾個情況:
1、這兩對引物檢測了68個樣品,兩對引物檢測67個樣本的檢測結(jié)果是一致的。
2、從糧農(nóng)組織在越南用于研究宏基因組學(xué)分析收集的對蝦肝胰臟組織(每個池塘10蝦)的14個樣本中,其中8個樣品具有積極的AHPND病理特征,但PCR檢測結(jié)果顯示5個為陽性結(jié)果3個為陰性結(jié)果(兩對引物檢測顯示結(jié)果);而5個樣品的AHPND病理特征不明顯的,兩對引物PCR檢測結(jié)果均為陰性結(jié)果。
3、68個測試樣本中分理出5株副溶血弧菌的AHPND樣本中,并通過生物鑒定都可以導(dǎo)致AHPND病變,其中有3個樣品是在2002年在對蝦底泥中分離得到的弧菌,并被證實并不會引起暴發(fā)AHPND(兩對引物檢測結(jié)果顯示呈陰性),另外2株在水體及蝦體取得的樣本,尚未進行生物測試。
4、有一個弧菌生物測定不會導(dǎo)致AHPND的組織病理,但是養(yǎng)殖過程中的卻造成高死亡率并伴隨著肝胰腺組織病變癥狀,兩對引物PCR檢測結(jié)果均為陽性。
5、新分離的瓦氏菌(Shewanella)、紅球菌(Rhodococcus)、賴氏細菌(Leifsonia)、戴爾福特菌( Delftia)、青枯菌(Ralstonia)、創(chuàng)傷弧菌(V. vulnificus)、哈維氏弧菌( V. harveyi)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)和枯草芽孢桿菌(B. subtilis)的兩對引物檢測結(jié)果為陰性。
至此,我們不能保證所闡述的方法與每個可能的非AHPND細菌的樣本或者其它有機體沒有交叉反應(yīng)。我們也不能保證這種方法能檢測出每一株可能引起對蝦AHPND的細菌。我們也邀請所有行業(yè)人員,幫助我們進行進一步的驗證、改進這個檢測方法。
我們初步的序列拼接和序列比較分析表明,我們已經(jīng)確定了的目標(biāo)序列來自細菌的質(zhì)粒DNA并不是來自于AHPND菌株的染色體DNA。如果這個假設(shè)被證實,這也將影響AHPND有關(guān)的毒力傳導(dǎo)機制。然而確定毒素所需的時間目前還無法確定。由于情況緊急,我們決定發(fā)布PCR檢測引物序列信息,它將作為一個臨時檢測工具,直到毒素被確定。